Khoảng hơn 1 tháng trước, NSƯT Khôi Nguyên ho kéo dài và uống thuốc không khỏi, sốt nhiều nên gia đình cho đi kiểm tra và phát hiện ông bị ung thư tụy. Ông được vợ và các con luân phiên chăm sóc tại nhà riêng ở quận Hà Đông, Hà Nội.

Những năm tháng cuối đời, ông hết mình vì sự nghiệp và gia đình. Trong khoảng thời gian điều trị bệnh, ông dành nhiều thời gian cho gia đình và cùng người bạn đời đi du lịch được nhiều nơi.

NSƯT Khôi Nguyên sinh năm 1943. Ông bén duyên với sân khấu cải lương từ năm 1959, lúc mới 16 tuổi. Ngày ấy, sân khấu cải lương đang ở thời điểm huy hoàng, được nhiều khán giả đón nhận. Trong gần nửa cuộc đời dành cho sân khấu cải lương, nam nghệ sĩ đã kinh qua nhiều vở diễn với nhiều dạng nhân vật trong các vở: “Khi thành phố lên đèn”, “Đôi dòng sữa mẹ”, “Sứ giả của tình yêu”…

Trong đó, vở “Sứ giả của tình yêu” ông đóng cùng nghệ sĩ Thanh Thanh Hiền được xem là vở diễn “để đời” làm nên thương hiệu Khôi Nguyên trong sân khấu cải lương.

Công tác ở Nhà hát sân khấu cải lương một thời gian thì NSƯT Khôi Nguyên chuyển sang quản lý. Ông có thời gian 4 năm đi giảng dạy tại khoa Kịch hát Dân tộc, ĐH Sân khấu - Điện ảnh Hà Nội. Trong thời gian công tác tại Nhà hát Cải lương Việt Nam, ông đã được phong danh hiệu Nghệ sĩ Ưu tú năm 1992.

Năm 2000, khi đã ngoài 50 tuổi, NSƯT Khôi Nguyên mới bén duyên với những bộ phim truyền hình. Lối diễn ấn tượng, có chiều sâu của ông trong các phim "Bác Cả người sung sướng", "Cựu chiến binh", "Bí thư Tỉnh ủy", "Chạy án", "Tình yêu không hẹn trước"... được nhiều người yêu mến.